有30多亿年历史的蓝藻(又称蓝细菌，Cynaobacteria)，在淡水、海水、土壤等广泛分布，甚至在极端环境中也能生存。蓝藻在水体中大量死亡会形成有害蓝藻水华(Harmful Cyanobacterial Blooms，HCBs)，蓝藻水华在全球出现并暴发的强度和频率在近几十年均有增加，严重威胁到周边区域的社会、生态与经济发展[1-2]。蓝藻水华在我国湖泊水体中的暴发广受关注，但需要注意的是，其在海水环境中同样会引起严重危害[3-5]。因此，有关其降解机理研究具有广泛的普适性。微囊藻毒素(Microcystins，MCs)是HCBs产生的次级代谢产物，也是分布最广的氰毒素[6-7]。藻细胞内的MCs通过自然衰老或细胞裂解被释放到水体中[8]，MCs通过抑制真核细胞中的蛋白磷酸酶和氧化应激，严重毒害多种动植物、生态系统及人类的健康[9-13]。我国海域近年来蓝藻水华灾害有上升趋势[14]，如何去除MCs成了海域水体即将面临的一个严重问题。当前，MCs的毒性及其对环境和社会经济的负面影响很大，为了消除饮用水中的MCs，科学界提出了氯化、臭氧化、光催化和电解等物理化学方法[15-17]。但其在有害副产物的形成、低效率和高运营成本方面都有一定的局限性[18]。因此，生物降解作为一种环境友好、经济有效的MCs去除方法，越来越受到人们的重视[19-20]，并认为是一种主要的技术手段[21]。

鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium)是一类革兰氏阴性非发酵杆状细菌，广泛分布于各种复杂的环境，多为严格好氧型或兼性厌氧型，代谢类型复杂多样，适应能力极强，其在盐度为0.5%以下的河口区均可存活[22]。自多食鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium multivorum)和嗜温鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium thalpophilum)被发现具有石油降解能力，该菌属即受到广泛关注[23-24]。在蓝藻水华暴发过程中，大量的营养物质氮、磷等元素会随着MCs的释放进入自然水体[25-26]。MCs在不同的营养基质存在下可以自然生物降解，因此，在不同的营养条件下对MCs生物降解动力学的差异进行评价显得尤为重要[27]。但营养基质对MCs生物降解的影响机制尚未被完全了解[28]；氮和碳2种营养元素对MCs降解速率的影响尚存争议[29-31]。截至目前，只有少数研究涉及受磷影响的MCs生物降解，应该对不同氮磷比下的MCs生物降解进行更多的研究[32]。蓝藻水华中筛选驯化得到的新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium)对MCs降解效果良好[33]，MCs降解途径主要是由mlr基因簇(mlrA、mlrB、mlrC、mlrD)参与的，mlr基因簇是微囊藻毒素降解菌有效利用MCs的特异性基因[34-35]。本文研究碳、氮和磷营养元素对MCs好氧微生物降解过程的影响，以期揭示各营养元素对水体中MCs降解速率影响的规律，从而为河口、湖泊及近岸水体MCs污染治理提供理论依据。

实验对象为实验室保存的从蓝藻水华中筛选驯化得到的菌株Novosphingobium sp. ERN07。

无水葡萄糖、硝酸钠、无水乙醇，西陇化工股份有限公司；标准品MC-RR (分子式：C49H75N13O12；分子量：1 038.2)、MC-LR (分子式：C49H74N10O12；分子量：995.2)，纯度≥95% HPLC纯化级，用色谱级甲醇溶解，配制成初始浓度MC-RR 50 μg/L、MC-LR 50 μg/L的MCs混合液；EasyPure RNA Kit、TransScriptTM All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (One-Step gDNA Removal)试剂盒、PerfectStartTM Green qPCR SuperMix试剂盒，北京全式金生物有限公司。

高效液相色谱仪，岛津公司；三重四级杆串联质谱仪和实时荧光定量PCR仪，Applied Biosystem公司；PCR仪，Bio-Rad公司；台式高速冷冻离心机，上海力申科学仪器有限公司。

MSM无机盐培养基参照文献[18]配制，1×105 Pa灭菌20 min。

多营养因素的ERN07降解正交试验：在MSM无机盐培养基中共设试验组9组，空白1组，每组3个平行(表 1)。30 ℃、200 r/min摇床培养，0、5、10、15 h取样，用LC-MS/MS检测MCs浓度。

单营养因素的ERN07降解实验，每组3个平行。30 ℃、200 r/min摇床培养，0、5、10、15 h取样，用LC-MS/MS检测MCs浓度。

15 h收集整瓶反应液用EasyPure RNA Kit进行RNA提取实验。将提取的RNA置于-80 ℃保存备用。

反转录反应体系(20 μL)：总RNA 15 μL，TransScript All-in-One SuperMix for qPCR 4 μL，gDNA Remover 1 μL。

以反转录获得的cDNA在ABI7300 Real-Time PCR System进行实时荧光定量PCR，检测ERN07降解微囊藻毒素的mlrA、mlrB、mlrC、mlrD基因，引物序列见表 2，每组基因做3个平行重复，取平均Ct值。使用ERN07 16S rRNA基因作为内参以减少误差。

数据采集软件为7500 System SDS Software Version 2.3。采用通用的相对定量数学模型2-△△Ct法进行计算，评估基因相对表达结果。使用统计软件SPSS 17.0对所得数据进行方差分析和t检验，并检验对照组与实验组中MCs降解的差异显著性。

其中Ct是目的基因的阈值周期，Ct 16S rRNA是16S rRNA基因的阈值周期。

在空白实验组中，所有样品的初始MCs浓度均未见明显降低，表明实验中MCs的减少可以归因于生物降解。由图 1、图 2分析可知，MC-RR实验组1、2、5、6、7、9以及MC-LR实验组1、2、4、5、6、7在0-5 h时降解变化不大，降解率都小于10%。10 h内MC-RR实验组1、6、7和MC-LR实验组1降解变化仍小于10%。15 h内降解率高于20%的有MC-RR实验组3、4、8、9和MC-LR实验组3、5、6、7、8、9。经计算，实验组3 ERN07对MC-RR和MC-LR平均降解速率分别为1.78 μg/(L·h)和1.98 μg/(L·h)，高于其他MC-RR实验组0.20-0.98 μg/(L·h)和MC-LR实验组1.40-1.92 μg/(L·h)的平均降解速率水平。结合图 3可明显看出，实验组3 (磷酸盐500 mg/L、硝酸钠1 000 mg/L、葡萄糖1 000 mg/L)营养条件下菌株的降解效果最好，在15 h内对MC-RR和MC-LR降解率分别为54%和56%。

由表 3正交试验分析可知，在95%的置信水平下，各因素(磷酸盐、硝酸钠、葡萄糖)对微藻囊毒素的生物降解均有影响。其中，磷酸盐对ERN07降解微藻囊毒素影响最大，其次是葡萄糖和硝酸钠。由表 4和表 5可知，各因素对生物降解的影响在0.01的显著性水平上极显著(P < 0.01)，并且各水平之间对MCs降解率影响差异显著(P < 0.05)。课题组前期的基础降解实验已经获得在标准MSM条件下ERN07对MCs 15 h的降解率为93%的结果。因此，上述正交试验设计的条件全部抑制降解，而试验组3 (磷酸盐500 mg/L，硝酸钠1 000 mg/L，葡萄糖1 000 mg/L)的降解效果在正交试验组中最好，所以选择试验组3的各单因素条件进行后续实验。

如图 4所示，在标准MSM培养基(磷源浓度约为4 500 mg/L，无其他碳源氮源)中菌株降解率很高，15 h内对MCs (50 μg/L)的降解率为93%，而营养物质的添加显著抑制降解(P < 0.05)，如添加葡萄糖(1 000 mg/L)的条件下，菌株对MC-RR和MC-LR的降解率分别为6.1%和25.9%；添加硝酸钠(1 000 mg/L)的条件下，菌株对MC-RR和MC-LR的降解率分别为2.9%和3.3%。降低磷源浓度(调节MSM培养基中磷酸盐浓度为500 mg/L)显著抑制降解(P < 0.05)，菌株对MC-RR和MC-LR的降解率分别为4.6%和5.1%。

采用SYBR Green实时荧光定量PCR技术，对ERN07在不同营养条件下mlrA、mlrB、mlrC和mlrD基因相对表达情况进行分析。结果如图 5所示，MCs诱导ERN07 mlr基因簇表达，而在各营养条件下MCs生物降解过程中mlrA、mlrB、mlrC和mlrD这4种基因相对表达量均降低，将标准MSM条件下各基因相对表达量视为1，添加1 000 mg/L葡萄糖的条件下，mlrA、mlrB、mlrC、mlrD基因相对表达量分别下调66.9%、91.3%、74.5%和61.2%；添加1 000 mg/L硝酸钠的条件下，mlrA、mlrB、mlrC、mlrD基因相对表达量分别下调82.8%、90.6%、63.1%和79.4%；500 mg/L磷酸盐条件下，mlrA、mlrB、mlrC、mlrD基因相对表达量分别下调78.6%、91.9%、54.7%和75.9%。mlr基因簇对营养条件的扰动有不同的响应，其中mlrB的相对表达量极显著低于相同条件下mlrA、mlrC、mlrD的相对表达量(P < 0.01)。mlrA、mlrD变化趋势大致相同(P > 0.05)，均显著下调(P < 0.05)。

本文研究了碳、氮、磷源生态因子对Novosphingobium sp. ERN07降解微囊藻毒素的影响，与标准MSM条件相比，随着磷酸盐浓度降低，降解速率减慢(图 4)。磷是影响MCs微生物降解的重要因素[36]。杨霞等[37]发现在有磷酸钾的情况下，Novosphingobium sp. THN1作用6 h去除MC-LR的量为28.73%±9.70%，在所有条件中降解速度最快。外加可溶性磷源可显著促进沉积物表层微生物MC-LR的降解(P < 0.01)，磷源促进降解的作用可能是代谢过程中产生了可以促进藻毒素降解酶分泌的物质，或MCs的降解产物与添加的磷源物质的代谢产物之间发生了协同作用或共代谢作用[38]。Shimizu等[39]研究表明，耐碱性降解菌可在藻华发生和藻塌过程中，以及蓝藻光合作用引起的碱性条件下实现更有效的MCs生物修复。本实验测得附加磷源的初始pH被确定为弱碱性(7.6)。菌株在用磷源进行MCs生物降解时表现最好，表明该菌株具有耐碱性，在水华发生和崩塌过程中，利用生物ERN07消除MCs具有特别的指导意义。

与无碳源条件相比，葡萄糖的加入降低了生物降解速率(图 4)。周洁等[40]发现葡萄糖明显抑制Delftia acidovorans对MC-RR和MC-LR的生物降解，而杨霞等[37]发现外加碳源对沉积物中MC-LR的好氧降解没有显著影响。此外，100 mg/L葡萄糖条件下不同的生物降解可能与季节变化有关，Li等[41]发现秋季100 mg/L葡萄糖对活性膜中微生物降解没有影响，冬季100 mg/L葡萄糖对微生物降解MC-LR影响较弱[42]。葡萄糖添加对于MCs降解的抑制作用可能是因为MCs降解酶易受分解代谢物(如葡萄糖)抑制[29, 32, 43]；其次，糖代谢产物(如有机酸)可以通过降低pH值和影响降解来降低细菌的生存能力[31]。

与无氮源条件相比，硝酸钠的加入也降低了生物降解速率(图 4)。以往的研究将MC-LR与硝酸盐的生物降解归结为厌氧去硝化与生物降解的结合[25, 32]。如果MC-LR降解菌利用硝氮作为最终电子受体，NO3-的加入会促进MCs的降解过程[32]。本研究结果表明，NO3-的加入会抑制降解，说明本实验过程中MCs降解菌未利用NO3-作为最终电子受体，因此MCs的降解过程与反硝化过程未发生耦合。降解受抑制的原因可能是由于添加硝酸盐造成的氧化还原电位的增加[43]。此外，硝酸盐对MCs生物降解的影响还具有硝酸盐浓度依赖性和接种依赖性[44]。

葡萄糖和硝酸钠作为碳源和氮源，对生物降解抑制作用的影响机制可能相似，如果培养基中含有其他氮/碳源，微生物会优先利用容易利用的含氮/碳化合物，为其快速发育繁殖提供必要的能量和物质，从而延迟降解菌对MCs的降解；当含氮/碳化合物快要耗尽时，菌体数量也较为庞大，种间竞争激烈，于是藻毒素即作为碳、氮源来供给生物生长，但此时由于错过了细菌快速生长期时对MCs的快速降解利用，最终导致MCs的去除率降低[45]。

对比以上单营养因素降解实验和正交试验组3的结果，试验组3对MC-RR和MC-LR的降解率分别为54.4%和56.3%。试验组3在磷源浓度很低的条件下降解率仍然较高，这说明葡萄糖和硝酸钠组成的双重营养物质对MCs生物降解抑制作用弱于单源的葡萄糖或硝酸钠，这一结论与Li等[32]的研究一致：一方面，NO3-可以减少葡萄糖代谢过程中酸性物质的积累，因而不会显著影响MCs的生物降解；另一方面，葡萄糖可能会促进菌群对NO3-的吸收，从而减小NO3-对MCs生物降解的抑制作用[36]。

成功的MCs生物修复不仅依赖于MCs降解菌群的变化，还依赖于MCs生物降解过程中mlr基因表达的动态变化[28]。本研究将不同生态因子条件下的生物降解动力学与mlr基因簇的诱导率联系起来，结果显示，降解的MCs与mlr的诱导率呈正相关，与标准MSM相比，外加葡萄糖、硝酸钠以及降低磷酸盐浓度会在转录水平上负调控mlr基因簇表达，使得MCs的降解效率降低。Shimizu等[46]对mlrA基因的RT-PCR结果显示，MCs的去除与mlrA基因拷贝数成正比。Jones等[47]假设对MCs生物降解的负调控可能涉及易于利用的底物对微胱氨酸酶合成的抑制。Li等[42]认为葡萄糖能抑制mlrA基因丰度的增加，与浓度无关。本研究表明不同降解基因在相同营养条件下的响应存在差异，而mlrA和mlrD的表达趋势相似(P > 0.05)，mlrA和mlrD可能在不同条件下的生物降解过程中共同转录，与Li等[42]研究结果一致。此外，Li等[38]发现与mlrA相比，mlrD基因表达的调控与生物降解动力学的相关性更强，在降解中作用更重要。由于营养物质对MCs生物降解的影响机制研究不够，还需要考虑其他因素和观点进行深入研究，如微胱氨酸酶活性的动态变化。

较低的mlr基因簇诱导率与葡萄糖、硝酸钠的添加及低浓度的磷酸盐有关，考虑到添加碳、氮源营养物质的生物降解减慢，应该强调在水华发生之前有效去除水环境中的碳源和氮源。本研究为高效生物治理水体MCs污染提供理论依据，对MCs污染治理有一定的应用价值。